notícies

En l'última dècada, la tecnologia de seqüenciació genètica s'ha utilitzat àmpliament en la investigació del càncer i la pràctica clínica, convertint-se en una eina important per revelar les característiques moleculars del càncer. Els avenços en el diagnòstic molecular i la teràpia dirigida han promogut el desenvolupament de conceptes de teràpia de precisió tumoral i han comportat grans canvis en tot el camp del diagnòstic i el tractament tumoral. Les proves genètiques es poden utilitzar per advertir del risc de càncer, guiar les decisions de tractament i avaluar el pronòstic, i són una eina important per millorar els resultats clínics dels pacients. Aquí, resumim els articles recents publicats a CA Cancer J Clin, JCO, Ann Oncol i altres revistes per revisar l'aplicació de les proves genètiques en el diagnòstic i el tractament del càncer.

Mutacions somàtiques i mutacions germinals. En general, el càncer està causat per mutacions d'ADN que es poden heretar dels pares (mutacions germinals) o adquirir amb l'edat (mutacions somàtiques). Les mutacions germinals són presents des del naixement, i el mutador sol portar la mutació a l'ADN de cada cèl·lula del cos i es pot transmetre a la descendència. Les mutacions somàtiques són adquirides per individus en cèl·lules no gamètiques i normalment no es transmeten a la descendència. Tant les mutacions germinals com les somàtiques poden destruir l'activitat funcional normal de les cèl·lules i conduir a la transformació maligna de les cèl·lules. Les mutacions somàtiques són un factor clau de malignitat i el biomarcador més predictiu en oncologia; no obstant això, aproximadament entre el 10 i el 20 per cent dels pacients amb tumors porten mutacions germinals que augmenten significativament el seu risc de càncer, i algunes d'aquestes mutacions també són terapèutiques.
Mutació impulsora i mutació passatgera. No totes les variants d'ADN afecten la funció cel·lular; de mitjana, calen de cinc a deu esdeveniments genòmics, coneguts com a "mutacions impulsores", per desencadenar la degeneració cel·lular normal. Les mutacions impulsores sovint es produeixen en gens estretament relacionats amb les activitats de la vida cel·lular, com ara gens implicats en la regulació del creixement cel·lular, la reparació de l'ADN, el control del cicle cel·lular i altres processos vitals, i tenen el potencial de ser utilitzades com a dianes terapèutiques. Tanmateix, el nombre total de mutacions en qualsevol càncer és força gran, que va des d'uns quants milers en alguns càncers de mama fins a més de 100.000 en alguns càncers colorectals i endometrials altament variables. La majoria de les mutacions no tenen cap o una significació biològica limitada, fins i tot si la mutació es produeix a la regió codificant, aquests esdeveniments mutacionals insignificants s'anomenen "mutacions passatgera". Si una variant gènica en un tipus de tumor concret prediu la seva resposta o resistència al tractament, la variant es considera clínicament operable.
Oncogens i gens supressors de tumors. Els gens que muten amb freqüència en el càncer es poden dividir aproximadament en dues categories, oncogens i gens supressors de tumors. En les cèl·lules normals, la proteïna codificada pels oncogens té principalment el paper de promoure la proliferació cel·lular i inhibir l'apoptosi cel·lular, mentre que la proteïna codificada pels gens oncosupressors és principalment responsable de regular negativament la divisió cel·lular per mantenir la funció cel·lular normal. En el procés de transformació maligna, la mutació genòmica condueix a l'augment de l'activitat dels oncogens i a la disminució o pèrdua de l'activitat dels gens oncosupressors.
Petita variació i variació estructural. Aquests són els dos tipus principals de mutacions del genoma. Les variants petites alteren l'ADN canviant, eliminant o afegint un petit nombre de bases, incloent-hi la inserció de bases, l'eliminació, el desplaçament del marc de lectura, la pèrdua de codons d'inici, les mutacions de pèrdua de codons d'aturada, etc. La variació estructural és una gran reorganització del genoma, que implica segments de gens que van des d'uns quants milers de bases fins a la major part del cromosoma, incloent-hi canvis en el nombre de còpies de gens, l'eliminació de cromosomes, la duplicació, la inversió o la translocació. Aquestes mutacions poden causar una reducció o millora de la funció de les proteïnes. A més dels canvis a nivell de gens individuals, les signatures genòmiques també formen part dels informes de seqüenciació clínica. Les signatures genòmiques es poden veure com a patrons complexos de petites variacions i/o estructurals, incloent-hi la càrrega de mutació tumoral (TMB), la inestabilitat de microsatèl·lits (MSI) i els defectes de recombinació homòloga.

Mutació clonal i mutació subclonal. Les mutacions clonals són presents en totes les cèl·lules tumorals, són presents en el moment del diagnòstic i romanen presents després que avanci el tractament. Per tant, les mutacions clonals tenen el potencial de ser utilitzades com a dianes terapèutiques tumorals. Les mutacions subclonals són presents només en un subconjunt de cèl·lules canceroses i es poden detectar al començament del diagnòstic, però desapareixen amb la recurrència posterior o apareixen només després del tractament. L'heterogeneïtat del càncer es refereix a la presència de múltiples mutacions subclonals en un sol càncer. Cal destacar que la gran majoria de les mutacions impulsores clínicament significatives en totes les espècies comunes de càncer són mutacions clonals i romanen estables durant la progressió del càncer. La resistència, que sovint està mediada per subclons, pot no detectar-se en el moment del diagnòstic, però apareix quan recau després del tractament.

La tècnica tradicional FISH o cariotip cel·lular s'utilitza per detectar canvis a nivell cromosòmic. La FISH es pot utilitzar per detectar fusions, delecions i amplificacions de gens, i es considera el "patró d'or" per detectar aquestes variants, amb alta precisió i sensibilitat però amb un rendiment limitat. En algunes malalties hematològiques, especialment la leucèmia aguda, el cariotip encara s'utilitza per guiar el diagnòstic i el pronòstic, però aquesta tècnica s'està substituint gradualment per assaigs moleculars dirigits com ara FISH, WGS i NGS.
Els canvis en gens individuals es poden detectar mitjançant PCR, tant PCR en temps real com PCR digital per gotes. Aquestes tècniques tenen una alta sensibilitat, són particularment adequades per a la detecció i el seguiment de petites lesions residuals i poden obtenir resultats en un temps relativament curt. L'inconvenient és que el rang de detecció és limitat (normalment només es detecten mutacions en un o pocs gens) i la capacitat de realitzar múltiples proves és limitada.
La immunohistoquímica (IHC) és una eina de monitorització basada en proteïnes que s'utilitza habitualment per detectar l'expressió de biomarcadors com ara ERBB2 (HER2) i receptors d'estrogen. La IHC també es pot utilitzar per detectar proteïnes mutades específiques (com ara BRAF V600E) i fusions de gens específiques (com ara fusions d'ALK). L'avantatge de la IHC és que es pot integrar fàcilment en el procés rutinari d'anàlisi de teixits, de manera que es pot combinar amb altres proves. A més, la IHC pot proporcionar informació sobre la localització de proteïnes subcel·lulars. Els desavantatges són l'escalabilitat limitada i les altes demandes organitzatives.
Seqüenciació de segona generació (NGS) La NGS utilitza tècniques de seqüenciació paral·lela d'alt rendiment per detectar variacions a nivell d'ADN i/o ARN. Aquesta tècnica es pot utilitzar per seqüenciar tant el genoma complet (WGS) com les regions gèniques d'interès. La WGS proporciona la informació de mutació genòmica més completa, però hi ha molts obstacles per a la seva aplicació clínica, com ara la necessitat de mostres de teixit tumoral fresc (la WGS encara no és adequada per analitzar mostres immobilitzades en formalina) i l'alt cost.
La seqüenciació NGS dirigida inclou la seqüenciació d'exons complets i un panell de gens diana. Aquestes proves enriqueixen les regions d'interès mitjançant sondes d'ADN o amplificació per PCR, limitant així la quantitat de seqüenciació necessària (tot l'exoma constitueix entre l'1 i el 2% del genoma, i fins i tot els panells grans que contenen 500 gens només constitueixen el 0,1% del genoma). Tot i que la seqüenciació d'exons complets funciona bé en teixits fixats amb formalina, el seu cost continua sent elevat. Les combinacions de gens diana són relativament econòmiques i permeten flexibilitat en la selecció dels gens que s'han d'analitzar. A més, l'ADN lliure circulant (cfDNA) està sorgint com una nova opció per a l'anàlisi genòmica de pacients amb càncer, coneguda com a biòpsies líquides. Tant les cèl·lules canceroses com les cèl·lules normals poden alliberar ADN al torrent sanguini, i l'ADN despreses de les cèl·lules canceroses s'anomena ADN tumoral circulant (ctDNA), que es pot analitzar per detectar possibles mutacions en cèl·lules tumorals.
L'elecció de la prova depèn del problema clínic específic que s'ha d'abordar. La majoria dels biomarcadors associats amb teràpies aprovades es poden detectar mitjançant tècniques FISH, IHC i PCR. Aquests mètodes són raonables per a la detecció de petites quantitats de biomarcadors, però no milloren l'eficiència de la detecció amb l'augment del rendiment, i si es detecten massa biomarcadors, és possible que no hi hagi prou teixit per a la detecció. En alguns càncers específics, com el càncer de pulmó, on les mostres de teixit són difícils d'obtenir i hi ha múltiples biomarcadors per provar, l'ús de NGS és una millor opció. En conclusió, l'elecció de l'assaig depèn del nombre de biomarcadors que s'han de provar per a cada pacient i del nombre de pacients que s'han de provar per al biomarcador. En alguns casos, l'ús d'IHC/FISH és suficient, especialment quan s'ha identificat l'objectiu, com ara la detecció de receptors d'estrogen, receptors de progesterona i ERBB2 en pacients amb càncer de mama. Si es requereix una exploració més completa de les mutacions genòmiques i la cerca de possibles objectius terapèutics, la NGS és més organitzada i rendible. A més, es pot considerar la NGS en casos en què els resultats d'IHC/FISH siguin ambigus o no concloents.

Diferents directrius donen orientació sobre quins pacients haurien de ser elegibles per a proves genètiques. El 2020, el Grup de Treball de Medicina de Precisió de l'ESMO va publicar les primeres recomanacions de proves NGS per a pacients amb càncer avançat, recomanant proves NGS rutinàries per a mostres de càncer de pulmó no escamós no petit avançat, càncer de pròstata, càncer colorectal, càncer de conducte biliar i tumors de càncer d'ovari, i el 2024, l'ESMO va actualitzar sobre aquesta base, recomanant la inclusió del càncer de mama i tumors rars. Com ara tumors estromals gastrointestinals, sarcomes, càncers de tiroide i càncers d'origen desconegut.
El 2022, l'Opinió Clínica de l'ASCO sobre proves del genoma somàtic en pacients amb càncer metastàtic o avançat estableix que si s'aprova una teràpia relacionada amb biomarcadors en pacients amb tumors sòlids metastàtics o avançats, es recomana proves genètiques per a aquests pacients. Per exemple, s'han de realitzar proves genòmiques en pacients amb melanoma metastàtic per detectar mutacions BRAF V600E, ja que els inhibidors de RAF i MEK estan aprovats per a aquesta indicació. A més, també s'han de realitzar proves genètiques si hi ha un marcador clar de resistència per al fàrmac que s'ha d'administrar al pacient. L'Egfrmab, per exemple, és ineficaç en el càncer colorectal mutant KRAS. A l'hora de considerar l'adequació d'un pacient per a la seqüenciació de gens, s'han d'integrar l'estat físic del pacient, les comorbiditats i l'estadi tumoral, ja que la sèrie de passos necessaris per a la seqüenciació del genoma, inclòs el consentiment del pacient, el processament de laboratori i l'anàlisi dels resultats de la seqüenciació, requereixen que el pacient tingui una capacitat física i una esperança de vida adequades.
A més de les mutacions somàtiques, alguns càncers també s'han de provar per detectar gens germinals. Les proves de mutacions de la línia germinal poden influir en les decisions de tractament per a càncers com les mutacions BRCA1 i BRCA2 en càncers de mama, ovari, pròstata i pàncrees. Les mutacions de la línia germinal també poden tenir implicacions per a la detecció i la prevenció del càncer en futurs pacients. Els pacients que són potencialment aptes per a les proves de mutacions de la línia germinal han de complir certes condicions, que impliquen factors com ara antecedents familiars de càncer, edat en el moment del diagnòstic i tipus de càncer. Tanmateix, molts pacients (fins a un 50%) portadors de mutacions patogèniques a la línia germinal no compleixen els criteris tradicionals per a les proves de mutacions de la línia germinal basades en els antecedents familiars. Per tant, per maximitzar la identificació de portadors de mutacions, la National Comprehensive Cancer Network (NCCN) recomana que tots o la majoria dels pacients amb càncer de mama, ovari, endometri, pàncrees, colorectal o pròstata es facin proves de mutacions de la línia germinal.
Pel que fa al moment de les proves genètiques, atès que la gran majoria de les mutacions impulsores clínicament significatives són clonals i relativament estables al llarg de la progressió del càncer, és raonable realitzar proves genètiques en pacients en el moment del diagnòstic de càncer avançat. Per a proves genètiques posteriors, especialment després d'una teràpia molecular dirigida, les proves d'ADN ct són més avantatjoses que l'ADN del teixit tumoral, perquè l'ADN sanguini pot contenir ADN de totes les lesions tumorals, cosa que és més propícia per obtenir informació sobre l'heterogeneïtat del tumor.
L'anàlisi del ctDNA després del tractament pot ser capaç de predir la resposta del tumor al tractament i identificar la progressió de la malaltia abans que els mètodes d'imatge estàndard. Tanmateix, no s'han establert protocols per utilitzar aquestes dades per guiar les decisions de tractament, i no es recomana l'anàlisi del ctDNA tret que sigui en assajos clínics. El ctDNA també es pot utilitzar per avaluar petites lesions residuals després de la cirurgia tumoral radical. Les proves de ctDNA després de la cirurgia són un fort predictor de la progressió posterior de la malaltia i poden ajudar a determinar si un pacient es beneficiarà de la quimioteràpia adjuvant, però encara no es recomana utilitzar el ctDNA fora dels assajos clínics per guiar les decisions de quimioteràpia adjuvant.

Processament de dades El primer pas en la seqüenciació del genoma és extreure ADN de mostres de pacients, preparar biblioteques i generar dades de seqüenciació en brut. Les dades en brut requereixen un processament addicional, com ara filtrar dades de baixa qualitat, comparar-les amb el genoma de referència, identificar diferents tipus de mutacions mitjançant diferents algoritmes analítics, determinar l'efecte d'aquestes mutacions en la traducció de proteïnes i filtrar les mutacions de la línia germinal.
L'anotació del gen conductor està dissenyada per distingir les mutacions del conductor i del passatger. Les mutacions del conductor provoquen la pèrdua o l'augment de l'activitat dels gens supressors de tumors. Les variants petites que condueixen a la inactivació dels gens supressors de tumors inclouen mutacions sense sentit, mutacions de desplaçament del marc de lectura i mutacions clau del lloc d'empalmament, així com la deleció de codons d'inici menys freqüents, la deleció de codons d'aturada i una àmplia gamma de mutacions d'inserció/deleció d'introns. A més, les mutacions de sentit erroni i les petites mutacions d'inserció/deleció d'introns també poden conduir a la pèrdua de l'activitat dels gens supressors de tumors quan afecten dominis funcionals importants. Les variants estructurals que condueixen a la pèrdua de l'activitat dels gens supressors de tumors inclouen la deleció parcial o completa de gens i altres variants genòmiques que condueixen a la destrucció del marc de lectura del gen. Les variants petites que condueixen a una funció millorada dels oncogens inclouen mutacions de sentit erroni i insercions/delecions ocasionals d'introns que es dirigeixen a dominis funcionals importants de les proteïnes. En casos rars, el truncament de proteïnes o les mutacions del lloc d'empalmament poden conduir a l'activació d'oncogens. Les variacions estructurals que condueixen a l'activació d'oncogens inclouen la fusió de gens, la deleció de gens i la duplicació de gens.
La interpretació clínica de la variació genòmica avalua la importància clínica de les mutacions identificades, és a dir, el seu potencial valor diagnòstic, pronòstic o terapèutic. Hi ha diversos sistemes de classificació basats en l'evidència que es poden utilitzar per guiar la interpretació clínica de la variació genòmica.
La base de dades d'oncologia de medicina de precisió (OncoKB) del Memorial Sloan-Kettering Cancer Center classifica les variants gèniques en quatre nivells segons el seu valor predictiu per a l'ús de fàrmacs: Nivell 1/2, biomarcadors aprovats per la FDA o clínicament estàndard que prediuen la resposta d'una indicació específica a un fàrmac aprovat; Nivell 3, biomarcadors aprovats o no aprovats per la FDA que prediuen la resposta a nous fàrmacs dirigits que han demostrat ser prometedors en assajos clínics, i Nivell 4, biomarcadors no aprovats per la FDA que prediuen la resposta a nous fàrmacs dirigits que han demostrat evidència biològica convincent en assajos clínics. Es va afegir un cinquè subgrup associat amb la resistència al tractament.
Les directrius de l'American Society for Molecular Pathology (AMP)/American Society of Clinical Oncology (ASCO)/College of American Pathologists (CAP) per a la interpretació de la variació somàtica divideixen la variació somàtica en quatre categories: Grau I, amb forta significació clínica; Grau II, amb significació clínica potencial; Grau III, significació clínica desconeguda; Grau IV, no se sap si és clínicament significativa. Només les variants de grau I i II són valuoses per a les decisions de tractament.
L'Escala d'Operabilitat Clínica de Dianes Moleculars (ESCAT) de l'ESMO classifica les variants gèniques en sis nivells: Nivell I, dianes adequades per a l'ús rutinari; Fase II, una diana que encara s'està estudiant, probablement s'utilitzarà per cribrar la població de pacients que es podrien beneficiar del fàrmac diana, però es necessiten més dades per donar-hi suport. Grau III, variants gèniques dirigides que han demostrat un benefici clínic en altres espècies de càncer; Grau IV, només variants gèniques dirigides avalades per evidència preclínica; En grau V, hi ha evidència que dóna suport a la importància clínica de dirigir-se a la mutació, però la teràpia amb un sol fàrmac contra la diana no allarga la supervivència o es pot adoptar una estratègia de tractament combinat; Grau X, manca de valor clínic.